Cách đổ đĩa Petri không bị nhiễm tạp | Hướng dẫn tạo đĩa ” LB agar ” dùng trong phòng thí nghiệm

Trong bài viết này, bạn sẽ được hướng dẫn từng bước chuẩn bị, tiệt trùng và rót đĩa LB agar vô trùng — quy trình chuẩn được chia sẻ bởi Addgene, tổ chức phi lợi nhuận hàng đầu trong chia sẻ tài nguyên sinh học.

Các plasmid có thể mang một hoặc nhiều gen kháng kháng sinh, giúp vi khuẩn chứa chúng có khả năng đề kháng với loại kháng sinh tương ứng.
Nhờ đặc điểm này, các nhà nghiên cứu có thể dễ dàng phân biệt và chọn lọc các vi khuẩn mang plasmid mong muốn khỏi quần thể vi khuẩn không mang plasmid, thông qua chọn lọc nhân tạo – tức là nuôi cấy chúng trong môi trường có chứa kháng sinh phù hợp.

Môi trường Luria Broth (LB) là môi trường dinh dưỡng giàu chất, được sử dụng phổ biến để nuôi cấy vi khuẩn trong phòng thí nghiệm.
Khi bổ sung agar vào LB, môi trường trở thành thạch LB (LB agar) – một dạng gel rắn mà vi khuẩn có thể phát triển trên bề mặt. Vi khuẩn không thể tiêu hóa agar, nhưng vẫn có thể hấp thụ các chất dinh dưỡng hòa tan trong LB.

Nếu thêm kháng sinh vào môi trường LB agar, chỉ những vi khuẩn mang gen kháng tương ứng (thường nằm trên plasmid) mới có thể phát triển.
Điều này cho phép chúng ta chọn lọc chính xác các dòng vi khuẩn chứa plasmid mang gen kháng kháng sinh cần nghiên cứu.

Phần hướng dẫn dưới đây sẽ giúp bạn cách đổ đĩa petri không bị nhiễm tạp và tự chuẩn bị đĩa LB agar có chứa kháng sinh, phục vụ cho các thí nghiệm biến nạp plasmid, phân lập dòng vi khuẩn, và chọn lọc kháng sinh.

1. Cách đổ đĩa Petri không bị nhiễm tạp (Hướng dẫn làm đĩa LB Agar chuẩn trong phòng thí nghiệm vi sinh)

Trước khi bắt đầu quy trình này, hãy xem video hướng dẫn bên dưới để nắm được cách thức hoạt động của toàn bộ quy trình.

2.Thiết bị và hóa chất cần chuẩn bị

2.1 Thiết bị (Equipment)

• Autoclave (nồi hấp tiệt trùng)
• Bể nước (water bath)
• Micropipette (Pipetman)
• Bình thủy tinh có thể hấp tiệt trùng (autoclavable flasks)
• Pipet vô trùng (sterile pipettes)
• Xô đá (ice bucket) – dùng để giữ kháng sinh lạnh trong quá trình thao tác

2.2 Hóa chất và vật tư (Reagents)

Để pha 1 lít môi trường LB agar, cần:

→ Tổng cộng 37 g bột LB agar pha sẵn
→ Hòa tan trong 1 lít nước vô trùng (Sterile H₂O)

🧫 Đĩa Petri vô trùng có kích thước mong muốn:

• Addgene thường sử dụng đĩa 60 mm × 15 mm, mỗi đĩa chứa 5–10 mL agar,
• Trên mỗi đĩa có thể phân biệt tối đa khoảng 100 khuẩn lạc riêng biệt.

💡 Mẹo: Nếu bạn cần sàng lọc số lượng lớn khuẩn lạc, nên dùng đĩa có đường kính lớn hơn. Nhiều phòng thí nghiệm sử dụng đĩa 90 mm × 15 mm, có thể chứa 10–15 mL agar, phù hợp cho các thí nghiệm có mật độ mẫu cao.

[Thêm hình ảnh: So sánh kích thước đĩa Petri 60 mm và 100 mm]

2.3 Kháng sinh (Antibiotic)

Chuẩn bị kháng sinh ở nồng độ gốc 1000×, hòa tan trong dung môi phù hợp (xem bảng bên dưới).
Trong hầu hết các trường hợp, kháng sinh có thể hòa tan trong nước cất (dH₂O).

Ghi chú (Notes)

• Bột kháng sinh có thể hòa tan trong nước cất vô trùng (dH₂O).
• Carbenicillin có thể được dùng thay cho ampicillin. Ưu điểm: bền hơn và hiệu quả hơn trong việc chọn lọc chính xác vi khuẩn chứa plasmid mong muốn (ít xuất hiện khuẩn lạc vệ tinh). Nhược điểm: giá thành cao hơn.

3. Quy trình làm đĩa LB agar

Cân 37 g bột LB agar pha sẵn cho mỗi lít agar nóng chảy mà bạn muốn pha. Khối lượng chính xác sẽ tùy vào số lượng đĩa cần rót.

Ví dụ: nếu bạn muốn làm 20 đĩa, mỗi đĩa chứa tối đa 10 mL agar, thì cần tổng cộng 200 mL môi trường. Tuy nhiên, bạn nên luôn pha dư một chút (~220 mL) để bù hao hụt do đổ tràn hoặc sai số khi đo.

👉 Với 220 mL LB agar, cần: (37 g/L) × (0.220 L) = 8,14 g bột LB agar pha sẵn.

1. Cho lượng bột LB agar đã cân vào chai thích hợp để hấp tiệt trùng.

   • Với 400 mL agar, dùng chai 1 L.

   • Với 200 mL agar, dùng chai 500 mL.
     → Phần không gian trống giúp tránh agar bị sôi trào khi hấp.

2. Thêm 220 mL nước vô trùng vào cùng chai, xoay nhẹ để tạo hỗn dịch đồng nhất.

3. Đậy nắp hoặc bọc giấy nhôm, không siết kín.

4. Dán băng autoclave tape lên chai: Khi hấp xong, băng sẽ chuyển màu đậm nếu đã đạt ít nhất 10 phút ở 121 °C.

5. Ghi nhãn chai bằng lab tape với: Tên viết tắt, ngày pha, nội dung trong chai.

Đặt chai chứa môi trường vào nồi hấp và cài đặt ở: 121 °C, 20 psi, thời gian 30 phút.

Áp suất cao giúp ngăn dung dịch sôi trào trong khi vẫn đảm bảo nhiệt độ diệt khuẩn hiệu quả.

💡 Mẹo: Dù nhiệt độ này đủ để tiêu diệt hầu hết tác nhân gây nhiễm, một số bào tử có thể vẫn sống sót. Nếu bạn làm việc với các vi sinh vật đặc biệt hoặc bào tử cứng, hãy tham khảo tài liệu để chọn phương pháp tiệt trùng phù hợp hơn.

Trong lúc agar đang được tiệt trùng, hãy chuẩn bị bàn thao tác:

1. Chọn một khu vực trống trên bàn có ngọn lửa đang cháy.

2. Xịt ethanol 70%, lau sạch bằng khăn giấy.

3. Đếm đủ số lượng đĩa cần rót, xếp thành chồng.

4. Ghi nhãn đĩa với:

   • Ngày pha,

   • Loại môi trường,

   • Loại kháng sinh (nếu có).

💡 Mẹo: Bạn có thể dùng mã màu bút dạ để đánh dấu các loại kháng sinh khác nhau (ví dụ: xanh = ampicillin, đỏ = kanamycin, vàng = chloramphenicol).

Trước khi thêm kháng sinh vào agar, bạn cần chuẩn bị dung dịch stock 1000×.

Ví dụ: Nếu muốn nồng độ cuối cùng là 100 µg/mL ampicillin, hãy pha:

• 100 mg ampicillin vào 1 mL nước vô trùng,

• Hòa tan bằng máy vortex,

• Sau đó lọc vô trùng (filter-sterilize) qua màng 0.22 µm.

1. Chuẩn bị bể nước 60 °C có đủ nước để ngập khoảng ¾ chiều cao chai chứa agar.

2. Sau khi hấp xong, mở hé cửa autoclave khoảng 10 phút để hơi nước thoát ra và agar nguội bớt.

3. Dùng găng tay cách nhiệt để lấy chai ra, sau đó đặt vào bể nước.

4. Giữ trong bể ít nhất 5 phút.

   • Không để nước trong bể chạm vào cổ hoặc nắp chai (vì nước bể không vô trùng).

💡 Mẹo: 60 °C là nhiệt độ lý tưởng: agar vẫn ở dạng lỏng, nhưng phần lớn kháng sinh chưa bị phân hủy. Để kiểm tra chính xác, nên dùng nhiệt kế laser hoặc cảm biến nhiệt.

1. Bật ngọn lửa tại khu vực rót.

2. Thêm kháng sinh vào chai agar ấm (~60 °C) theo tỉ lệ 1:1000.

3. Lắc xoáy nhẹ để kháng sinh phân tán đều.

4. Mở từng đĩa Petri gần ngọn lửa và bắt đầu rót:

   • Có thể dùng pipet vô trùng cho 1–2 đĩa đầu tiên để ước lượng thể tích.

   • Sau đó rót trực tiếp từ chai cho nhanh.

5. Mỗi đĩa chứa khoảng 5–10 mL agar.

6. Sau khi rót, xoay nhẹ đĩa để agar dàn đều và loại bỏ bọt khí.

7. Đậy nắp ngay sau khi rót và xếp chồng 4–5 đĩa/lần.

💡 Mẹo : Nếu agar bắt đầu đông lại trong chai → dừng rót và làm lại mẻ mới. Với agar không chứa kháng sinh, có thể làm chảy lại bằng nồi hấp hoặc lò vi sóng (cẩn thận tránh sôi trào!).

1. Để các đĩa agar đông rắn ở nhiệt độ phòng (~30 phút).

2. Sau đó, để qua đêm để agar khô hoàn toàn.

3. Cho đĩa vào túi nhựa kín kèm vật liệu hút ẩm để tránh ngưng tụ nước.

4. Bảo quản ở 4 °C cho đến khi sử dụng.

Để đảm bảo kháng sinh trên đĩa vẫn còn hiệu lực:

1. Lấy ra hai đĩa agar.

2. Trên đĩa thứ nhất: cấy chủng vi khuẩn kháng kháng sinh.

3. Trên đĩa thứ hai: cấy chủng nhạy cảm.

4. Ủ qua đêm ở nhiệt độ nuôi cấy thích hợp (thường 37 °C).

✅ Kết quả đạt yêu cầu: Chỉ có chủng kháng phát triển, còn chủng nhạy không mọc khuẩn lạc.

4. Kiểm tra kết quả

Trong tất cả các trường hợp dưới đây: (-) biểu thị chủng vi khuẩn không có khả năng kháng kháng sinh, (+) biểu thị chủng vi khuẩn có khả năng kháng kháng sinh.

Tổng hợp: Cương – NpsLab.vn | Nguồn: Addgene